雜交捕獲的原理是人工設(shè)計(jì)探針(DNA探針或者RNA探針),探針可以和目標(biāo)區(qū)段部分或者全部互補(bǔ)。將樣本和探針混合,探針會將目標(biāo)區(qū)段捕獲,未設(shè)計(jì)探針的區(qū)段會被洗脫丟棄,之后通過變性(一般是調(diào)節(jié)PH值到堿性)將探針和捕獲區(qū)段分開,被捕獲的片段即可進(jìn)行二代測序文庫構(gòu)建。
雜交捕獲流程介紹:
1、文庫制備
將提取后的基因組DNA利用超聲或酶切的方法將基因組DNA進(jìn)行片段化,并進(jìn)行末端修復(fù)和接頭連接,接著進(jìn)行PCR及純化。
2、雜交反應(yīng)
將帶有生物素標(biāo)記的RNA/DNA探針,對DNA文庫的目標(biāo)區(qū)域片段進(jìn)行結(jié)合(探針應(yīng)過量)。
3、鏈霉親和素磁珠結(jié)合
使用鏈霉親和素磁珠結(jié)合帶有生物素標(biāo)記的RNA/DNA探針與DNA文庫相結(jié)合的雙鏈復(fù)合物。
4、清洗
利用不同鹽濃度的緩沖液進(jìn)行多次清洗,主要目的為去除未被探針捕獲的非特異性雜交,保留目標(biāo)區(qū)域的DNA從而達(dá)到捕獲效率的提升。
5、捕獲后擴(kuò)增
對捕獲及清洗后的DNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,構(gòu)建完成靶向富集的測序文庫。
雜交捕獲的優(yōu)缺點(diǎn)都是什么呢?
優(yōu)點(diǎn):捕獲區(qū)段大,可以達(dá)到幾百M(fèi)B,遠(yuǎn)超PCR方案和MIP方案,同時(shí)根據(jù)探針的原理其均一性很好,均一性是評價(jià)捕獲技術(shù)很關(guān)鍵的參數(shù),均一性好后續(xù)測序成本就會下降。
缺點(diǎn):容易捕獲非目標(biāo)片段,造成成本增加。因?yàn)殡s交前樣本會被隨機(jī)打斷一般認(rèn)為500bp是比較合適的長度,探針捕獲時(shí)可能和目標(biāo)片段部分雜交,導(dǎo)致一些含有部分目標(biāo)區(qū)段的片段被捕獲。所以雜交捕獲的特異性較差,容易捕獲非目標(biāo)區(qū)段。