簡(jiǎn)要描述:MICH TLX DNA建庫(kù)試劑盒是為illumina平臺(tái)設(shè)計(jì)的 DNA 文庫(kù)準(zhǔn)備試劑盒,適用于起始量1 ng-200 ng 的 DNA 樣本,試劑盒經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化,能夠快速構(gòu)建文庫(kù)(2.5-3.5小時(shí)),有高效的文庫(kù)轉(zhuǎn)化率與擴(kuò)增效率。
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供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 主要用途 | 用于DNA建庫(kù)。 |
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應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),制藥 |
MICH TLX DNA-seq kit (illumina Compatible)
MICH TLX DNA建庫(kù)試劑盒 #NGS 0602-96(96 rxns)
MICH TLX DNA-seq kit (illumina Compatible) 是為 illumina 平臺(tái)設(shè)計(jì)的 DNA 文庫(kù)準(zhǔn)備試劑盒, 適用于起始量 1 ng-200 ng 的 DNA 樣本,試劑盒經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化,能夠快速構(gòu)建文庫(kù)(2.5-3.5 小時(shí)),有高效的文庫(kù)轉(zhuǎn)化率與擴(kuò)增效率,已經(jīng)經(jīng)過(guò)多樣本驗(yàn)證可獲得優(yōu)異的文庫(kù)與測(cè)序數(shù)據(jù),可 用于石蠟包埋組織 DNA 樣本建庫(kù)。試劑盒包含了 DNA 片段化和末端修復(fù)加 A 尾的預(yù)混液、連接預(yù) 混液、高保真擴(kuò)增預(yù)混液、短接頭和含有 INDEX 的 PCR 引物(可以根據(jù)客戶要求進(jìn)行選配)。
產(chǎn)品組分
TLX Buffer Mix
TLX Enzyme Mix
TLX ligase Enzyme
TLX ligase Buffer
TLX Adapter for ILM
PCR Master Mix
使用方法
磁珠: Cat#A63881,AMPure XP Beads 或其他等效產(chǎn)品。
DNA 質(zhì) 控:Cat#Q33238,life qubit4.0;Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 或 其 他等效產(chǎn)品。
其他材料:Nuclease-free water、低吸附 EP 管、無(wú)水乙醇、TE Buffer(10 mM TrisHCl,pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、磁力架、PCR 管、PCR 儀等。
使用流程
圖1. DNA 文庫(kù)準(zhǔn)備流程圖
實(shí)驗(yàn)步驟
片段化 / 末端修復(fù) / 加 A 尾(Fragment/End Preparation/dA-Taling)
1. 將所需試劑解凍后,顛倒混勻,置于冰上備用。
2. 于無(wú)菌 PCR 管中配制下表所示反應(yīng)體系。
試劑名稱(chēng) | 體積 |
TLX Buffer Mix | 4 μL |
TLX Enzyme Mix | 3.2 μL |
gDNA | X |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
表 1. 片段化 / 末端修復(fù) /dA 尾反應(yīng)體系
3. 吹打或振蕩混勻,并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。
4. 按下表設(shè)置反應(yīng)程序(熱蓋設(shè)置為 82℃) ,將上述 PCR 管置于 PCR 儀中反應(yīng)。
溫度 | 時(shí)間 |
37℃ | 20 min |
72℃ | 20 min |
4℃ | Hold |
表 2. 片段化 / 末端修復(fù) / 加 dA 尾反應(yīng)程序
接頭連接(Adapter Ligation)
1. 將所需試劑解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。
2. 如下表所示配制反應(yīng)體系。
試劑名稱(chēng) | 體積 |
dA-tailed DNA(3.1 步驟產(chǎn)物) | 20 μL |
TLX ligase Enzyme | 2 μL |
TLX ligase Buffer | 8 μL |
TLX Adapter for ILM | 2 μL |
Nuclease-free water | Up 40 μL |
表 3. 接頭連接反應(yīng)體系(接頭詳細(xì)說(shuō)明見(jiàn)注意事項(xiàng) 二)
3、吹打或振蕩混勻,并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。
4、將上述 PCR 管置于 PCR 儀中 22℃,孵育 60min。
【注】:當(dāng)投入 DNA 量較低,實(shí)驗(yàn)效果不理想時(shí),可嘗試將連接時(shí)間延長(zhǎng)。
連接產(chǎn)物磁珠純化(Post Ligation Clean Up)
A. 產(chǎn)物純化操作步驟(必選)
1、準(zhǔn)備工作:將 AMPure XP Beads 室溫平衡 30 min。配制 80% 乙醇。
2、吸取 48 μL AMPure XP Beads (1 .2×,Beads:DNA=1.2:1) 至接頭連接產(chǎn)物中, 渦旋混 勻或移液器吹打 10 次混勻,室溫孵育 5 min。
3、短暫離心并置于磁力架上,待溶液澄清后(約 5 min),棄上清。
4、保持 PCR 管始終置于磁力架中,加入 200 μL 新鮮配制的 80% 乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec,棄上清。
5、重復(fù)步驟 4。
6、保持 PCR 管始終置于磁力架中,開(kāi)蓋干燥磁珠至剛出現(xiàn)龜裂(約 5 min)*。
7、
1) 如產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)行片段分選,將 PCR 管從磁力架中取出,磁珠 ( 無(wú)需用水洗脫 ) 直接用于文庫(kù)擴(kuò)增步驟反應(yīng)。
2) 如產(chǎn)物需進(jìn)行雙輪分選, 加入 52-102 μL Nuclease-free Water,渦旋振蕩或輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置 5 min。將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清 后(約 5 min) ,小心移取 50-100 μL 上清至新 PCR 管中,切勿觸碰磁珠(洗脫體積越大,洗脫效率越高,分選效果越好,詳細(xì)說(shuō)明見(jiàn)注意事項(xiàng))。
* 等待磁珠干燥過(guò)程中,可配制 文庫(kù)擴(kuò)增步驟反應(yīng)體系。
B. 雙輪分選操作步驟(可選)
1、準(zhǔn)備工作:將 AMPure XP Beads 室溫平衡 30 min。配制 80% 乙醇。
2、根據(jù) DNA 片段長(zhǎng)度要求,參考表 4 向純化產(chǎn)物中加入第一輪分選磁珠,渦旋混勻或移液 器吹打 10 次混勻。
插入 DNA 片段大小 | 150 - 250 bp | 200-300 bp | 300-400 bp | 400-600 bp | 500-700 bp |
DNA 文庫(kù)大小 | 250 - 350 bp | 300-400 bp | 400-500 bp | 500-700 bp | 600-800 bp |
第一輪磁珠體積 | 0.70X | 0.65X | 0.62X | 0.48X | 0.44X |
第二輪磁珠體積 | 0.25X | 0.25X | 0.16X | 0.16X | 0.16X |
表 4 文庫(kù)雙篩對(duì)應(yīng)磁珠體積參照表
【注】:表中“0.7×”表示樣品 DNA 體積的 0.7 倍。如文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度為 200 bp,樣品 DNA 體積為 100 μL,則第一輪分選磁珠使用體積為 0.70×100 μL=70 μL;第二輪分選磁珠使用體積為 0.25×100 μL=25 μL。
3、室溫孵育 5min。將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中,待溶液澄清后(約 5 min) ,小 心轉(zhuǎn)移上清到干凈的 PCR 管中。
4、參考表 4 向上清中加入第二輪分選磁珠。渦旋混勻或移液器吹打 10 次混勻,室溫靜置 5 min。
5、 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中,待溶液澄清后(約 5 min),棄上清。
6、保持 PCR 管始終處于磁力架中,加入 200 μL 新鮮配制的 80% 乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec,棄上清。
7、重復(fù)步驟 6。
8、保持 PCR 管始終處于磁力架中,開(kāi)蓋干燥磁珠至剛出現(xiàn)龜裂(約 5 min)*。
9、將 PCR 管從磁力架中取出,磁珠 ( 無(wú)需用水洗脫 ) 直接用于文庫(kù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。
* 等待磁珠干燥過(guò)程中,可配制 文庫(kù)擴(kuò)增步驟反應(yīng)體系。
文庫(kù)擴(kuò)增(Library Amplification)
1、將表 5 所需試劑解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。
2、如下表所示配制反應(yīng)體系。
試劑名稱(chēng) | 體積 |
Adapter Ligated DNA(3.3 步驟產(chǎn)物) | 干燥后的磁珠 |
PCR Master Mix | 10 μL |
I7 Primer | 1 μL |
I5 Primer | 1 μL |
Nuclease-free water | 8 μL |
表 5 文庫(kù)擴(kuò)增反應(yīng)體系
【注】: 含有 Index 的 PCR 引物(i5 Prmier 和 i7 Primer) 信息詳見(jiàn) MichTM TLX Primer Kit(Catalog #NGS CD-0602-C)說(shuō)明。
3、將配置好的 PCR 反應(yīng)液加入到 3.3.1 或 3.3.2 步驟完成后的含有磁珠的 PCR 管中, 吹打或 振蕩混勻,并短暫離心。
4、按下表設(shè)置反應(yīng)程序,將上述 PCR 管置于 PCR 儀中反應(yīng)。
溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
98℃ | 2 min | 1 |
98℃ | 30 s |
參照注意事項(xiàng)四:關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增的表 1 |
65℃ | 30 s | |
72℃ | 40 s | |
72℃ | 4 min | 1 |
4℃ | Hold | * |
表 6 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序
產(chǎn)物磁珠純化(Post Amplification Clean Up)
同:產(chǎn)物純化操作步驟。使用 AMPure XP Beads(1×,Beads:DNA=1:1) 純化文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物, 最后加適量 Nuclease-free water(20-50 μL) 進(jìn)行洗脫(產(chǎn)物如需保存請(qǐng) 使用 TE Buffer 洗脫)。
文庫(kù)質(zhì)量控制
通常情況下,構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)濃度檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),具體請(qǐng)參見(jiàn):注意事項(xiàng)中的關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢。
注意事項(xiàng)
關(guān)于操作
1、請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2、使用前請(qǐng)將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后充分混勻,短暫離心后置于冰上待用。
3、混勻時(shí)請(qǐng)輕輕吹打或輕輕振蕩,劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫(kù)產(chǎn)出下降。
4、為避免樣品交叉污染,推薦使用帶濾芯的一次性槍頭。
5、推薦在帶熱蓋的 PCR 儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng),使用前應(yīng)預(yù)熱PCR 儀至反應(yīng)溫度附近。
6、請(qǐng)?jiān)跐崈舻膶?shí)驗(yàn)環(huán)境下實(shí)驗(yàn),避免污染。
TLX Adapter for ILM 說(shuō)明
1、TLX Adapter for ILM 采用短接頭模式。
2、接頭濃度:15 μM; 直接用于相應(yīng)建庫(kù)試劑盒連接體系里即可。
3、-20℃保存,使用前提前融化,盡量低溫融化,避免在超過(guò) 30℃的環(huán)境中融化。
4、建庫(kù)推薦使用量:常規(guī) DNA 投入量 100-200 ng, 2 μL/rxns;其他 DNA 投入量需要適當(dāng)調(diào) 整接頭使用量。
關(guān)于磁珠純化與分選
1、DNA 片段選擇步驟可在接頭連接后或文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行。
2、當(dāng) Input DNA 質(zhì)量≥ 50 ng, 建議在接頭連接后分選; 如 Input DNA 質(zhì)量<50 ng, 可在 文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行分選。
3、TLX Ligase Buffer 包含高濃度的 PEG,對(duì)雙輪磁珠分選產(chǎn)生顯著影響。因此,當(dāng)在接頭 連接后進(jìn)行片段選擇,須先進(jìn)行純化步驟,再進(jìn)行雙輪分選步驟;如在文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行片 段選擇,可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟。
4、磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫,并混勻再使用,否則會(huì)導(dǎo)致得率下降。
5、80% 乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,否則將影響回收效率。
6、進(jìn)行片段選擇時(shí), 初始樣品體積應(yīng)盡量≥ 100 μL, 初始樣本體積越大, 片段選擇效果越好。
關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增
1、文庫(kù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)與文庫(kù)產(chǎn)量和文庫(kù)質(zhì)量有直接關(guān)系,請(qǐng)參照下表列舉的本試劑盒設(shè)置擴(kuò)增 循環(huán)數(shù),并摸索合適的循環(huán)數(shù)。
DNA 投入量 | 獲得 100 ng 文庫(kù)需要循環(huán)數(shù) | 獲得 300 ng 文庫(kù)需要的循環(huán)數(shù) |
250 ng | 1-4 | 5-7 |
100 ng | 2-5 | 6-8 |
50 ng | 4-7 | 8-10 |
10 ng | 6-8 | 9-12 |
5 ng | 7-10 | 11-14 |
1 ng | 9-11 | 12-15 |
表 1. 文庫(kù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)參照表
【注】:如文庫(kù)擴(kuò)增后需要做片段選擇時(shí)參照較高循環(huán)數(shù)擴(kuò)增。
關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢
1、通常情況下,構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。
2、文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用:基于雙鏈 DNA 熒光染料的方法, 如 Qubit® 或 qPCR 絕對(duì)定量的方法。
3、文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè),可通過(guò) Agilent Bioanalyzer 2100 等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的 設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。
運(yùn)輸與保存方法
-20℃運(yùn)輸。
所有組分 -20° C 保存,有效期 1 年。
MICH TLX DNA建庫(kù)試劑盒產(chǎn)品信息
產(chǎn)品貨號(hào) | 名稱(chēng) | 規(guī)格 |
NGS 0602-8 | MICHTM TLX DNA-seq kit (illumina Compatible) | 8 rxns |
NGS 0602-24 | MICHTM TLX DNA-seq kit (illumina Compatible) | 24 rxns |
NGS 0602-96 | MICHTM TLX DNA-seq kit (illumina Compatible) | 96 rxns |
產(chǎn)品咨詢(xún)