DNA建庫(kù)中PCR擴(kuò)增子建庫(kù)方法應(yīng)用相對(duì)較少的原因
更新時(shí)間:2021-08-30 點(diǎn)擊次數(shù):2121
DNA建庫(kù)方法是分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)原理,其本質(zhì)就是在待測(cè)片段兩端加上接頭的過程。目前DNA建庫(kù)方法按照接頭連接方式不同可分為五類:TA克隆連接接頭建庫(kù)、Swift法建庫(kù)、轉(zhuǎn)座酶法建庫(kù)、PCR擴(kuò)增子建庫(kù)、平末端連接接頭建庫(kù)。 其中平末端連接接頭的方法基于Ion Torrent平臺(tái)。與Illumina平臺(tái)類似,Ion Torrent平臺(tái)的文庫(kù)構(gòu)建目的也是在片段化好的DNA片段兩端加上特定接頭,該方法一般包括4個(gè)步驟:DNA樣本片段化、末端修復(fù),連接adapter(PI和A/P1和X),選擇性回收DNA片段,文庫(kù)PCR富集,純化PCR產(chǎn)物。
需要注意的是:在Ion Torrent平臺(tái)構(gòu)建好的文庫(kù)通過油包水PCR種到測(cè)序柱子上,文庫(kù)中的X或A接頭是測(cè)序起始端,而P1接頭是是連到測(cè)序珠子的這一端。與Illumina通過采集熒光信號(hào)記錄記錄堿基序列的方法不同,Ion Torrent的測(cè)序是通過微環(huán)境中pH值短暫的下降被pH電極檢測(cè)到并且把測(cè)得的值傳給計(jì)算機(jī)記錄。
綜上,NGS建庫(kù)可以按照接頭加入目的片段的不同分為5種,其中TA克隆連接接頭建庫(kù)法應(yīng)用*泛,適用于絕大多數(shù)樣本建庫(kù),是目前商業(yè)化建庫(kù)方式的主流;Swift法與TA克隆連接接頭法類似,操作上相對(duì)繁瑣,P5接頭和P7接頭是分兩步連接上的;
轉(zhuǎn)座酶法只需1h 40min即可完成文庫(kù)構(gòu)建,可以節(jié)省大量的人力,但是在應(yīng)用上只適用于cDNA和全基因組等文庫(kù)的構(gòu)建,且轉(zhuǎn)座酶本身具有偏好性,對(duì)后續(xù)的測(cè)序質(zhì)量會(huì)有一定的影響;
PCR擴(kuò)增子建庫(kù)是捕獲建庫(kù)的一種,適用于臨床背景下靶向基因的研究,平末端連接接頭建庫(kù)適用于Ion Torrent平臺(tái),Ion Torrent*相對(duì)較低,所以此建庫(kù)方法應(yīng)用范圍相對(duì)較少。