蛋白質(zhì)的保存是一個比較棘手的問題,分子生物學(xué)實驗室的童鞋們或多或少都會碰到。
有沒有遇到過,不同批次純化的蛋白,采用同樣的測試方法,活性卻不太一樣?
有沒有遇到過新純化的蛋白,從冰箱拿出融化后,居然沉淀了?
蛋白質(zhì)純化后,保存方式都有哪些呢?
一、謹記蛋白質(zhì)的保存原則
低溫、分裝、濃縮、速凍/速融、添加劑
二、保存方法你知多少
蛋白質(zhì)的的保存方法的選擇取決于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及保存后什么時候再次使用你的蛋白。
1、如即提即用的話,可將濃縮蛋白質(zhì)儲存在單一溶液(如PBS),置于聚丙烯管或干凈的玻璃容器中,放在4°C冰箱保存。
優(yōu)點:蛋白容易獲得,可以快速進行實驗,且同一管樣品可重復(fù)取樣,這樣避免了因經(jīng)常解凍而加速蛋白的降解。
缺點:可能會面臨微生物污染,蛋白質(zhì)失活和氧化,可能對實驗數(shù)據(jù)的均一性造成影響。要避免這種情況,可以把蛋白質(zhì)分成小份儲存,并加入蛋白酶抑制劑、抗菌劑和還原劑等。但也要根據(jù)自己蛋白的情況,如果你的蛋白是完整的膜蛋白或分泌蛋白,很可能分子內(nèi)存在二硫鍵,為保證其完整性,應(yīng)該存儲在氧化環(huán)境中。另外,儲存時間超過一個月的蛋白可以考慮扔掉。
2、透析到合適的緩沖液中可以凍干,放4°保存;也可加高濃度的硫酸銨(你的蛋白不沉淀的話),4°保存。
注意:你要注意加入硫酸銨后pH會下降一些,你的緩沖液可不能太接近蛋白的等電點啊,蛋白在等電點附近沉淀很多時候是不可復(fù)溶,即使復(fù)溶活性也不能保證。
3、純化后的蛋白測濃度后,加入50%甘油,確認混勻后分裝,液氮速凍,放入-20度或-80度保存,尤其適用于酶類。
優(yōu)點:在低溫下,蛋白質(zhì)對微生物污染,蛋白酶降解和氧化反應(yīng)更有抵抗力,容易保證其活性。用甘油或乙二醇稀釋使蛋白處于溶液中,可以方便取樣。此外,這種方式儲存的蛋白質(zhì)可以保存長達一年,對于抗體軛合物是一個好的選擇。
缺點: 蛋白質(zhì)在-20°溶液中仍有可能遭受水解、污染和氧化,如果蛋白對還原性環(huán)境要求比較高,也需加入抑制劑、還原劑等。而且將樣品存放在50%冷凍保護劑中有時是不可取的,取決于你接下來要做的實驗。
4、有些蛋白可以不加甘油,直接液氮速凍幾分鐘,-80度保存。
優(yōu)點:可以長期保存(多年),不需要甘油、*等化學(xué)物質(zhì),避免蛋白質(zhì)降解或微生物污染。
缺點:冷凍蛋白質(zhì)應(yīng)一次性使用,為了避免反復(fù)凍融發(fā)生降解。此外,抗體軛合物(特別是堿性磷酸酶復(fù)合物)冷凍后可能會失活。
5、長期保存蛋白質(zhì)的另一個方式是凍干(lyophilization)。
優(yōu)點:蛋白質(zhì)凍干后會呈現(xiàn)蓬松的白色粉末形式,處于脫水的狀態(tài),可以在冰箱中無限期保存。
缺點:對于某些蛋白質(zhì),凍干操作有一個潛在問題就是蛋白質(zhì)不能復(fù)溶。凍干/復(fù)溶的過程同樣會對蛋白質(zhì)產(chǎn)生一定的傷害作用。
三、這些重點你要知道
1、保證恒定的pH值,一般PBS最為常用;
2、保證一定的蛋白濃度,如果濃度比較稀的話,可以考慮添加一定量的BSA;
3、甘油的添加也能在很大程度上提高抗體的穩(wěn)定性;
4. 為了防腐可以添加一定量的*(辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗一般不能加),如果樣品要用于生物學(xué)檢測,避免使用防腐劑。
5、無論是冷凍還是儲存在溶液中,將蛋白進行分裝,以避免凍融,降低污染的風險。
6、進行蛋白質(zhì)操作實驗時一定要帶手套,們的皮膚上有一些蛋白酶,這些蛋白酶很可能會降解掉我們的蛋白樣品。皮膚上的其他化學(xué)分子也可能會污染蛋白樣品。另外,為了防止細菌的生長,蛋白質(zhì)最好保存在滅菌的小管中。
7、避免反復(fù)凍融或凍干重溶解過程,這樣很可能會降低生物活性。
8、避免震蕩,震蕩產(chǎn)生的剪切力有可能會對蛋白質(zhì)產(chǎn)生破壞作用。震蕩時溶液中會產(chǎn)生氣泡,氧氣的進入會導(dǎo)致蛋白質(zhì)處在氧化環(huán)境中。蛋白質(zhì)中含有半胱氨酸,其極易被氧化為胱氨酸,這一過程很可能會破環(huán)蛋白質(zhì)的活性。